原位雜交ISH 整體實(shí)驗(yàn)方案

艾柏森（北京）生物科技有限公司

原理簡(jiǎn)介：

　原位雜交技術(shù)（in situhybridization）是以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異核酸分子的技術(shù)。使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

可以檢測(cè)cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各種種屬的標(biāo)本，包括哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、菌、植物標(biāo)本。也可以檢測(cè)組織芯片。

注：為了提高檢測(cè)的成功率，請(qǐng)?jiān)谌〔那案緲I(yè)務(wù)員聯(lián)系，確認(rèn)取材、固定、包埋要注意的事項(xiàng)。

樣品保存：
RNA 保存：
RNase 酶的存在使 RNA 保存變得困難。此酶廣泛存在于玻璃器皿上、試劑中以及操作人員身上及衣服上。RNase 可迅速破壞細(xì)胞中的 RNA 及 RNA 探針本身，因此用戶的實(shí)驗(yàn)過(guò)程、手套和溶液需要保證無(wú)菌，防止探針或組織 RNA 受到 RNase 的污染。

冷凍切片的一般樣品保存：
為了使保存的載片獲得好的結(jié)果，請(qǐng)勿將載片在室溫環(huán)境下干燥保存。正確方法是，將其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存，或?qū)⑵溆蒙瘋惏b膜覆蓋的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C條件下保存。這種保存方法可使載片保存數(shù)年。

探針選擇：

RNA 探針：

RNA 探針長(zhǎng)約 250–1500bp；長(zhǎng)度為800bp左右的探針具有較好的靈敏度和特異性。轉(zhuǎn)錄模板應(yīng)支持探針（反義鏈）和陰性對(duì)照（正義鏈）RNA 的轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄模板克隆至包含對(duì)生啟動(dòng)子的載體可實(shí)現(xiàn)這一目的。制備探針之前，必須對(duì)環(huán)狀模板進(jìn)行線性化，但也可使用 PCR 模板。

DNA 探針：

DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比，DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強(qiáng)度較弱，因此在雜交后的洗滌中不應(yīng)使用甲醛。

探針特異性至關(guān)重要。如果已知細(xì)胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列，則可據(jù)此設(shè)計(jì)高度精確的互補(bǔ)探針。如果超過(guò) 5% 的堿基對(duì)不互補(bǔ)，那么探針只能與靶序列發(fā)生輕度雜交。這意味著，探針更容易在洗滌和檢測(cè)步驟中被洗去，可能無(wú)法正確檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方案舉例：
(DIG)標(biāo)記RNA探針原位雜交實(shí)驗(yàn)方案

此方案介紹了如何使用DIG標(biāo)記的RNA單鏈探針來(lái)檢測(cè)石蠟包埋切片中目標(biāo)基因的表達(dá)情況。

1) 脫蠟

如為冷凍切片請(qǐng)從第 2 步開始操作。

如為甲醛固定的石蠟包埋切片，請(qǐng)繼續(xù)此步驟。

首先，對(duì)載片進(jìn)行脫蠟和復(fù)水操作。如果石蠟去除不*，則會(huì)導(dǎo)致切片的染色效果較差。

將載片置于支架上，然后執(zhí)行以下洗滌操作：

二甲苯：2x3 分鐘

1:1 的二甲苯和100%乙醇：3 分鐘

100%乙醇：2x3 分鐘

95%乙醇：3 分鐘

70%乙醇：3 分鐘

50%乙醇：3 分鐘

使用冰冷的自來(lái)水清洗

抗原修復(fù)步驟之前將載片置于自來(lái)水中。從這一步開始，不能使載片干燥，因?yàn)楦稍飼?huì)導(dǎo)致非特異性抗體結(jié)合和高背景染色。

2) 抗原修復(fù)

將含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris預(yù)熱并在37 °C條件下孵育酶解10–20分鐘。孵育時(shí)間和蛋白酶 K 的濃度可能需要根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化。

我們建議通過(guò)蛋白酶 K 滴定實(shí)驗(yàn)來(lái)確定合適條件。酶解不充分會(huì)導(dǎo)致雜交信號(hào)降低，過(guò)度酶解會(huì)影響組織形態(tài)，給雜交信號(hào)的定位帶來(lái)極大困難。蛋白酶 K 的*濃度會(huì)隨組織類型、固定時(shí)間和組織大小而發(fā)生變化。

3) 使用蒸餾水清洗載片5次。
4) 將載片浸入預(yù)冷的20% (v/v) 乙酸中20秒。這樣可使細(xì)胞通透化，使探針或抗體能夠透過(guò)。
5) 分別使用70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇洗滌載片（每次約1分鐘）使其脫水，然后風(fēng)干。
6) 向每個(gè)載片中加入 100 µL 雜交液。

鹽溶液 (20x)

4 M NaCl

100 mM EDTA

200 mM Tris-HCl pH 7.5

100 mM NaH2PO4.2H2O

100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

10 g聚蔗糖

10 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

10 g 牛血清白蛋白 (BSA)

500 ml無(wú)菌 dH2O

7) 將載片置于所需雜交溫度下的增濕雜交盒中孵育1 小時(shí)。雜交溫度的范圍通常為 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用雜交液稀釋探針。利用PCR儀在95 °C條件下加熱RNA 或DNA 2分鐘，使其變性。然后立即將探針置于冰上冷卻，以防止重退火。
9) 除去雜交液。向每個(gè)切片加入50–100μl探針稀釋液，覆蓋整個(gè)樣品。在 65 °C 條件下在增濕的雜交盒中孵育過(guò)夜。用蓋玻片蓋住樣品，以防樣品蒸發(fā)。

在此步驟中，RNA 探針會(huì)與相應(yīng)的mRNA雜交，或DNA探針會(huì)與相應(yīng)的細(xì)胞DNA雜交。雜交溫度的優(yōu)化取決于所用的探針序列以及細(xì)胞或組織類型。所分析的每種組織類型都需進(jìn)行雜交溫度的優(yōu)化。

探針的*雜交溫度取決于靶序列中堿基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鳥嘌呤的比例是關(guān)鍵因素。

10) 嚴(yán)格洗滌

通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、鹽濃度和洗滌劑濃度等溶液參數(shù)可消除非特異性相互作用。

配制 1 L 20x 檸檬酸鈉緩沖液 (SSC)

175.3 g 氯化鈉 (3 M)

88.2 g 檸檬酸鈉

800 mL 無(wú)菌水

使用檸檬酸將 pH 調(diào)節(jié)為5，定容至1 L 并使用高壓滅菌器進(jìn)行滅菌處理
洗滌 1

50% 甲酰胺的 2x SSC

3x5 分鐘，37-45 ℃

在較高溫度（高達(dá) 65° C）下短時(shí)間洗滌，洗去多余的探針和雜交緩沖液。如果洗滌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)洗掉大量的雜交探針 RNA/DNA。

洗滌 2

  0.1–2x SSC

  3x5 分鐘，25-75 ℃

此步驟會(huì)消除非特異性和/或重復(fù)性 DNA/RNA 雜交。

按照以下說(shuō)明對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)洗滌的溫度和鹽濃度進(jìn)行優(yōu)化：

· 對(duì)于極短的DNA/RNA 探針 (0.5–3 kb) 或極為復(fù)雜的探針，洗滌溫度應(yīng)更低（上限45 °C）且嚴(yán)格度更弱 (1–2xSSC)。

· 對(duì)于單基因座或較大的探針，溫度應(yīng)在65 °C 左右且嚴(yán)格度應(yīng)較強(qiáng)（低于0.5x SSC）。

· 對(duì)于重復(fù)性探針，溫度應(yīng)達(dá)到上限且嚴(yán)格度應(yīng)達(dá)到大（例如 α-衛(wèi)星重復(fù)序列）。

11) 在室溫下使用 MABT（含 Tween20 的馬來(lái)酸緩沖液）洗滌兩次，每次30分鐘。MABT 的性質(zhì)比PBS 更溫和，更適用于核酸檢測(cè)。

配制 5x MABT 母液

   58 g 馬來(lái)酸

   43.5 g NaCl

   55 g Tween-20

   900 mL 水

添加三羥甲基氨基甲烷，將 pH 調(diào)節(jié)至 7.5。大約需要 100 g 三羥甲基氨基甲烷。定容至 1 L。

12) 烘干載片。
13) 將其轉(zhuǎn)移至增濕盒中，向每個(gè)切片加入 200 µL 封閉緩沖液（MABT + 2% BSA，牛奶或血清）。在室溫下封閉 1–2 小時(shí)。
14) 去除封閉緩沖液。將抗標(biāo)記抗體以所需稀釋度加入封閉緩沖液。查看抗體說(shuō)明書中推薦的濃度/稀釋度。在室溫下孵育 1–2 小時(shí)。
15) 在室溫下使用 MABT 洗滌載片 5 次，每次 10 分鐘。
16) 在室溫下使用預(yù)染色緩沖液（100 mM Tris pH9.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）洗滌載片 2 次，每次 10 分鐘。
17) 如需進(jìn)行熒光檢測(cè)，請(qǐng)?zhí)恋?18 步。對(duì)于其他形式的檢測(cè)，請(qǐng)將載片放回增濕盒中，然后依照廠家說(shuō)明書(如有說(shuō)明書的話)使其顯色。

18) 使用蒸餾水清洗載片。
19) 將載片風(fēng)干 30 分鐘。然后使用 100% 乙醇進(jìn)行洗滌，并將其*風(fēng)干。
20) 使用 DePeX 封片溶液進(jìn)行封片。