蛋白異源表達純化那些事兒

研究蛋白質功能、生產功能型蛋白質基本都離不開蛋白質的異源表達及純化，今天小編將從以下幾個方面與大家聊一聊蛋白質表達、純化的那些事。

1、 標簽選擇

目前常見的表達標簽有His-tag（組氨酸標簽）、GST-tag（谷胱甘肽巰基轉移酶標簽）、MBP-tag（麥芽糖結合蛋白標簽）、CBD-tag（幾丁質結合區標簽）等。每種標簽都具有*的性質，比如標簽的分子量、對蛋白可溶性的調節能力、對蛋白折疊的影響、是否需切除等。根據自己要純化的蛋白的特性，選擇合適的標簽。標簽選的好，后續的實驗事半功倍。

2、 載體構建

選好要用的標簽后，就要準備構建表達載體了。目前已有很多商品化的載體可供選擇，例如帶His-tag的pET28系列，帶MBP-tag的pMAL系列等。絕大多數的載體系列，都包含了標簽插入N端或C端的形式，可以根據自己的蛋白的特質進行靈活選擇。插入蛋白的編碼基因時需要注意，不要出現移碼。如果想要自己從頭構建載體，別忘了插入合適的啟動子和轉錄終止序列。啟動子序列一般使用誘導型啟動子，組成型啟動子會導致外源蛋白過早表達積累，不利于宿主增殖。

3、 宿主選擇

常見的宿主有大腸桿菌、哺乳動物細胞、酵母以及昆蟲。以大腸桿菌來說，適合做異源表達的菌株為BL21及其衍生菌株，但仍需要根據載體中選擇的轉錄、翻譯元件來挑選。BL21中內源性的蛋白酶基因缺失，因此是一種適合于外源蛋白表達的菌株，但是它沒有T7 RNA聚合酶，所以不能用于含T7啟動子蛋白表達；BL21(DE3)，在BL21的基礎上整合了T7噬菌體基因組，適合T7表達系統，如pET系列；BL21(DE3)PLySs，在BL21(DE3)基礎，附帶了T7溶菌酶基因，可以更為嚴謹控制T7聚合酶的表達。需要注意的是，由于核酸內切酶（endA1）重組酶（recA1）等基因的存在，質粒在BL21系列菌株中不那么穩定，可能出現整合至基因組、丟失、突變等現象，所以構建好的載體仍需保存在DH5α之類的菌株中。

4、 培養條件優化

以大腸桿菌表達系統為例，菌種復蘇和種子培養時都可以使用LB培養基，在發酵階段使用氨基酸含量更高但糖源更低的培養基則更好，如TB培養基，以促進蛋白質的合成和積累。如果使用的是誘導型的啟動子，則應在菌體生長至對數生長期后期時加入IPTG之類的誘導劑。加入誘導劑后，培養溫度需要調低至16-30℃。培養溫度越低，蛋白質累積的越慢，越不容易產生包涵體。

5、 純化柱料選擇

每一種標簽都有對應的純化柱料。GST-tag使用谷胱甘肽凝膠，MBP-tag使用多糖樹脂，CBD-tag使用幾丁質樹脂，His-tag則使用偶聯了二價金屬離子的填料，其中常見的是偶聯鎳離子的，俗稱鎳柱。

NEBExpress鎳柱填料（S1428S）于2019年11月全新上市，另有預裝離心柱形式（S1427S/L)，更適合做篩選階段的小量蛋白純化，純化1mg His標記的蛋白質，只要15分鐘。

每 1 ml 鎳柱填料可純化≥10 mg 組氨酸標簽蛋白；

高特異性結合帶有His-tag的蛋白質，分離和純化后純度>95％；

牢固的鎳離子結合使其對 EDTA 和還原劑有*的耐受性，與常見的基于去污劑的細胞裂解試劑兼容。