技術服務 熒光原位雜交FISH

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,按照堿基互補的原則直接雜交結合到待檢測染色體或單鏈核酸上，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。進行定性、定位、相對定量分析。

   FISH技術優勢：操作簡單、檢測快速、結果易觀察、可檢測多種類樣品、空間定位準確、靈敏性和特異性高

   FISH臨床意義：指導臨床治療及藥物選擇、疾病的分期分型及預后判斷、形態學檢測的輔助手段

熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟

   FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術問世于20世紀70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術基礎上發展起來的。其基本原理是，按照兩個核酸的堿基序列互補原則，用特殊修飾的核苷酸分子標記DNA探針，然后將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯的單克隆抗體和探針分子特異性結合，經熒光檢測系統和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定量。

試驗方法如下：
1）玻片處理
（a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1%鹽酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化處理：玻片和蓋玻片1%（質量分數）鹽酸煮沸10min，烘干，錫紙包好4℃保存備用。
（c）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中10min，然后60℃烘干過夜備用。
（d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡處理(37℃、2h，室溫過夜)，高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃過夜。稱量試劑勺也要干烤。塑料器皿用滅菌的一次性塑料用品，使用前進行高壓消毒，為保證質量，凡使用的槍頭、試管等均經0.5mL/L DEPC水溶液處理3h以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進口已處理的無RNase和DNase的槍頭、試管可不必處理直接使用。
（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用1mL/L DEPC水配制。
2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：
（a）緩沖溶液
   1 X PBS緩沖溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超純水；
   3 X PBS緩沖溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超純水；
   通常配制成10 X PBS的儲備液，3 X PBS和1 X PBS可用DEPC水稀釋獲得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
   稱取2g PFA加入30ml約60℃的熱水，滴幾滴20% NaOH放在磁力攪拌器攪拌至*溶解。然后向其中加入16.5ml 3 X PBS緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用HCl調整至中性（7.2左右），拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水，定容在50ml。用0.45微米的膜過濾后使用。（室溫或4℃保存備用）。
注意：
   1、配制時應在通風條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及kou罩），因PFA有較強的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；
   2、加熱時，溫度不宜過高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；
   3、配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，應盡早使用。
   4% PFA是目前原位雜交組織化學技術中常用的固定液，它能較好地保持組織及細胞內的RNA，同時對形態保持也較好。樣品固定時間在2～3小時，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內生物大分子的過度交聯，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
（c）配制50%，80%，98%無水乙醇溶液，每個總量20mL。
（d）DAPI溶液
   用1ml ddH2O將DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量DAPI水溶液加到PBS中，制備成10～50 uM的DAPI溶液。
3）取樣及保存方法
（a）反應器沉淀前取樣2～5mL至離心管。
（b）離心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸餾水重復兩次）。
（c）樣品加入1mL多聚甲醛，搖勻，4℃下放置3h。
（d）樣品離心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1X PBS，搖勻，離心(10000r/min)5min，去上清夜（重復3次）。
（f）加0.5mL 1X PBS，0.5mL無水乙醇，搖勻，-20℃保存（可保存6個月）。
4）樣品固定：
   稀釋樣品3～5倍，對樣品進行超聲處理（3W超聲2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超聲5min），將活性污泥絮體打散成單個細胞以便于顯微鏡計數。然后取3μL樣品涂于包埋明膠的玻片上（檢查樣片本底），37℃的熱烘箱固定2h（或者在空氣中干燥2h或者過夜）。依次用50%、80%、98%（質量比）乙醇浸漬3min，對細胞進行脫水后，立放，并進行干燥。
5）樣品雜交
   試驗所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液（HybridizationBuffer, HB）和淋洗緩沖液（Washing Buffer, WB），其組分如表1-1和表1-2。
表1-1 雜交緩沖液（Hybridization Buffer）

表1-2淋洗緩沖液（Washing Buffer）

（a）吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46℃雜交爐中放置數分鐘。
（b）吸取10 uL探針貯存液和80 uL雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入46℃雜交爐中
預熱數分鐘；探針貯存液濃度為25ng/uL，用無菌水稀釋購買的探針，實驗用的探針序列及雜交條件見表1-3所示。
表1-3　用于檢測樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件

注：
（a） 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）
（c）吸取9uL預熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46℃下進行雜交（黑暗中進行），雜交時間為2～3h；
（d）雜交后的洗脫：打開恒溫水浴槽，加熱到48℃，對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進行預熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48℃水浴20min后用4℃冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺中揮干。
DAPI染色
   每孔滴9uLDAPI，4℃暗處5min，4℃冰水（BPS緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有360 nm激發波長，460nm發射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細胞計數。
封片
   涂封片劑，蓋蓋玻片，無氣泡后指甲油封裝。
熒光顯微鏡進行檢測
   每個樣品及每個探針都采集20個不同區域。每個區域中的細胞個數要超過1000個，然后進行平均以獲得每個探針對于每個樣品的雜交結果。細菌豐度或細菌數目（cells/g或cells/L）為AS1/(S2V)，其中A為視野中細菌平均數；S1為樣品涂抹面積；S2為視野涂抹面積；V為樣品體積。