新手小白細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)

轉(zhuǎn)染可謂是做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的大家經(jīng)常會(huì)考慮的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，大致原理也都是明白的。但是在實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到轉(zhuǎn)染效率太低，以至于無法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

到底轉(zhuǎn)染是什么呢？

為什么轉(zhuǎn)染效率不高呢？

其實(shí)

轉(zhuǎn)染，就是在真核細(xì)胞里導(dǎo)入具有生物功能的核酸，并在細(xì)胞中維持其生物功能。

轉(zhuǎn)染方法的選擇

我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導(dǎo)，化學(xué)介導(dǎo)，生物介導(dǎo)。

物理介導(dǎo)方法：電穿孔法、顯微注射和基因槍；

化學(xué)介導(dǎo)方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；

生物介導(dǎo)方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

但實(shí)驗(yàn)室使用較多的主要有化學(xué)介導(dǎo)中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和生物介導(dǎo)中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡(jiǎn)單，一般瞬時(shí)轉(zhuǎn)染選擇較多，但有些細(xì)胞系不容易轉(zhuǎn)染，因此選擇轉(zhuǎn)染方式時(shí)一定要做足功課，親身經(jīng)歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡(jiǎn)直崩潰。特別是養(yǎng)原代細(xì)胞的小伙伴，一點(diǎn)要認(rèn)真選擇！病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，且其對(duì)原代細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中更分為慢病毒轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染，其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合更為難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如懸浮細(xì)胞、T細(xì)胞、raw細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)

01

有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染

血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

轉(zhuǎn)染過程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液：在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物準(zhǔn)備過程以及復(fù)合物同細(xì)胞接觸過程。

在開始準(zhǔn)備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無血清的培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。但在復(fù)合物形成后，在加入細(xì)胞中前可以加入血清。

陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。

大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用一些營(yíng)養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。

對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE 2000。

02

培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。

這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。

對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率，融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。

03

細(xì)胞狀態(tài)

細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，原代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是*，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，zui適合轉(zhuǎn)染。

同時(shí)，我們都知道細(xì)胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染前的密度，失敗過很多次的經(jīng)歷告訴大家，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度更加重要。

有時(shí)候轉(zhuǎn)染時(shí)間太久，等到進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞已經(jīng)肆意生長(zhǎng)，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和轉(zhuǎn)染的時(shí)間進(jìn)行鋪板，建議選擇50%~80%區(qū)間密度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

04

細(xì)胞鋪板密度

用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。

一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。

鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明，對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的最佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。

05

啟動(dòng)子的選擇

獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。

CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性，同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV（勞斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高。

這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。

SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。

06

DNA量

高質(zhì)量的DNA對(duì)于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

其他的質(zhì)粒純化技術(shù)如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用*的陰離子交換樹脂純化DNA，可以得到用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量DNA。

另外，Marligen的純化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟很簡(jiǎn)單，可以在2小時(shí)內(nèi)完成。

07

瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)

DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測(cè)到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測(cè)不到其存在了。

瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。因此，表達(dá)水平與位臵無關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，實(shí)驗(yàn)必須很小心。

為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時(shí)就會(huì)如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含整合DNA的細(xì)胞很少，必須通過對(duì)藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過表型變化進(jìn)行鑒定。

穩(wěn)定基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)需要數(shù)周，如果需要驗(yàn)證蛋白產(chǎn)量，所需的時(shí)間更長(zhǎng)，但得到的細(xì)胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來源或用于得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

08

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測(cè)

基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率。

可以使用報(bào)告基因來確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測(cè)，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用簡(jiǎn)單的非同位素方法檢測(cè)b-gal的表達(dá)以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步驟，可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。

09

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選

連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系z(mì)ui常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通過磷酸化使藥物失活，從而提供對(duì)GENETCIN選擇性抗生素（G418 Sulfate）的抗性。抗生素抗性基因可以與目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染，兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對(duì)于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。

陽離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會(huì)提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細(xì)胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨(dú)使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞，低密度鋪板，給予生長(zhǎng)空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。

生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定最佳濃度。

篩選最多可能需要一周時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN抗生素存在條件下，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢苑謩e純化（克隆），收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。

10

蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇

哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細(xì)菌，真菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)，迅速地合成小量蛋白。常用的細(xì)胞系包括CHO，293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S細(xì)胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長(zhǎng)到高密度并合成更多蛋白，使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。

用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）。

無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物，限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇zuishihe您應(yīng)用的一種。

在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），對(duì)于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分，在這些情況下，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。

11

轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

1、較有效的驗(yàn)證方式必須是qPCR驗(yàn)證；

2、熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標(biāo)記（一般是GFP）還是非熒光標(biāo)記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標(biāo)記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能*證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗(yàn)證最為準(zhǔn)確。