噬菌體展示系列之抗體親和力成熟

近年來(lái)，隨著抗體藥物的廣泛上市，抗體已經(jīng)取代基因治療成為生物制藥領(lǐng)域的主要生力軍。而抗體在疾病診斷、治療和預(yù)防方面的作用很大程度上取決于其親和力的高低，隨著抗體工程技術(shù)的不斷發(fā)展，如何提高抗體親和力已成為抗體工程的難題之一。圍繞這一問(wèn)題人們已經(jīng)從不同的角度展開(kāi)了研究，例如，提高抗體庫(kù)的質(zhì)量、增加抗體庫(kù)的多樣性、進(jìn)行抗體重鏈或輕鏈的替換以及點(diǎn)突變有目的進(jìn)行氨基酸替換等都能不同程度地提高抗體親和力。

抗體親和力表示抗體與抗原結(jié)合能力的大小。抗體親和力成熟是指機(jī)體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中,再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。

噬菌體展示技術(shù)作為一種*的抗體庫(kù)構(gòu)建技術(shù)能結(jié)合多種技術(shù)手段，于體外實(shí)現(xiàn)抗體的親和成熟，并配合親和篩選方法獲得具有高親和力的抗體。在噬菌體抗體展示技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組，在一定程度上模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程。如果結(jié)合其它技術(shù)則可以使抗體的親和力提高到一個(gè)更高的層次，下面介紹一些抗體親和力成熟的方法。

體外抗體親和力成熟的幾種策略
要想實(shí)現(xiàn)抗體的親和力體外成熟，就必須充分地了解天然抗體的親和力體內(nèi)成熟原理，設(shè)計(jì)模擬體內(nèi)可能出現(xiàn)和存在的變化，從而促進(jìn)抗體的體外進(jìn)化。天然抗體的親和力成熟可以分為體細(xì)胞高頻突變和克隆選擇兩個(gè)過(guò)程。在天然抗體親和力成熟的過(guò)程中，抗原刺激下的體細(xì)胞高頻突變有著舉足輕重的作用，因此親和力體外成熟的策略也多在抗體基因突變水平上，即采用各種突變方法來(lái)模擬體內(nèi)的高頻突變。

1.隨機(jī)突變

(1)錯(cuò)配PCR
通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，提高核酸錯(cuò)配率將隨機(jī)突變引入基因序列。該技術(shù)可以通過(guò)提高鎂離子濃度、加入錳離子、失衡4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs) 濃度、使用低保真DNA聚合酶等方法，來(lái)提高抗體基因的突變率。除此之外，突變率的高低也可以采用改變模板DNA的復(fù)制次數(shù)進(jìn)行控制。復(fù)制次數(shù)越多，突變率將累積得越高。理論上經(jīng)過(guò)多輪的PCR反應(yīng)可獲得0.15%~3%的突變頻率，再用突變的抗體基因庫(kù)建立噬菌體抗體庫(kù)，最后從中篩選高親和力抗體。噬菌體展示技術(shù)有效的改善了使用錯(cuò)配PCR技術(shù)導(dǎo)致的抗體親和性和特異性的喪失，以及有效突變體過(guò)少的問(wèn)題。
(2) DNA改組
DNA改組技術(shù)是對(duì)同源的抗體基因,采用脫氧核糖核酸酶I將其切割成不超過(guò)50bp的.片段，再隨機(jī)組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增成完整的抗體基因。它包含了抗體片段隨機(jī)化切割、重組和篩選的過(guò)程，一定程度上模擬了天然抗體的親和力成熟過(guò)程，并加快了體外定向進(jìn)化速度。采用連續(xù)多輪的DNA改組具有去除有害突變優(yōu)勢(shì)。另外，DNA改組獲得的突變體，突變位點(diǎn)可以位于非抗原直接接觸的區(qū)域，有擴(kuò)大庫(kù)容的作用。

(3)鏈改組.
鏈改組即鏈替換技術(shù)，是固定抗體的一條輕鏈或重鏈不變，而將另一條重鏈或輕鏈經(jīng)過(guò)突變處理后，重新與固定鏈配對(duì)，以提高抗體親和力的方法。該方法保留一 條鏈不變，目的是為了保持抗體的特異性，而將經(jīng)過(guò)突變處理的另一條鏈與其配對(duì)，是為了增加抗體的親和力，以篩選到更高親和力的抗體,重復(fù)進(jìn)行鏈替換和親和力篩選將產(chǎn)生更高親和力的抗體。

將噬菌體展示技術(shù)與此技術(shù)結(jié)合構(gòu)建次級(jí)抗體庫(kù)將使該法更便利。鏈改組技術(shù)能有效提高抗體親和力，但如果無(wú)法明確了解zhiding抗原的基因結(jié)構(gòu)，或者抗體基因片段未能擁有一 個(gè)比較完整的初級(jí)抗體庫(kù)，則不適合使用鏈改組技術(shù)。

(4)突變株
EscherichiacoliMutD5是zui常用的大腸埃希菌突變株，該菌株可以校對(duì)和復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)缺陷，產(chǎn)生高頻率的單個(gè)堿基替換，突變率高于普通菌株105 倍。突變株法的優(yōu)勢(shì)是突變發(fā)生在轉(zhuǎn)化宿主菌后，而其他方法的突變均發(fā)生于轉(zhuǎn)化之前，而轉(zhuǎn)化效率是限制大容量突變庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵因素之一。使用突變株法可以構(gòu)建庫(kù)容為1012_ 104 個(gè)克隆的超大容量抗體庫(kù)，利用噬菌體展示技術(shù)篩選高親和抗體,通過(guò)該法的可以獲得一些未能在定向突變中獲得的突

艾柏森生物提供抗體親和力檢測(cè)服務(wù)如下

非標(biāo)記(Label-free) 交互分析是科學(xué)家用于研究生物分子之間相互作用的重要方法，艾柏森生物研究團(tuán)隊(duì)可運(yùn)用*的Biacore、ProteOn和octet系統(tǒng)對(duì)抗體的親和力和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行測(cè)量。 這些系統(tǒng)主要基于光學(xué)效應(yīng)的技術(shù)-表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)和生物膜層表面干涉技術(shù)(bio- layer interferometry, BLI)，可直接檢測(cè)分子間相互作用并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。親和力動(dòng)態(tài)測(cè)定方法表面等離子共振法(SPR) 是一種生物大分子相互作用分析(biomolecularinteraction analysis, BIA)技術(shù)，這種技術(shù)基于表面等離子共振的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù),不必使用熒光標(biāo)記或同位素標(biāo)記，從而讓保持了生物分子的天然活性，且可實(shí)時(shí)檢測(cè)抗原抗體等生物大分子相互作用的全過(guò)程。

SPR光譜可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傳感芯片表面液相折射率的變化，而這一變化和傳感芯片 表面所結(jié)合的生物分子的質(zhì)量成正比，共振單位(Response unit, RU)相對(duì)時(shí)間來(lái)表示。因此，通過(guò)分析反應(yīng)過(guò)程中各時(shí)刻的SPR光譜，可在非標(biāo)記的情況下監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用。
SPR技術(shù)特點(diǎn):
●Lable-Free技術(shù)， 無(wú)需利熒光素同位素等分子檢測(cè)
Real-Time技術(shù)，可直接、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)相互作用的全過(guò)程
●獲得分子相互作用的親和力及熱動(dòng)力學(xué)信息
●光路不經(jīng)過(guò)樣品，不受樣品顏色影響
●樣品消耗低，自動(dòng)化程度高
結(jié)果交付:
●和力報(bào)告(定量分析) :結(jié)合常數(shù)(Ka) 、解離常數(shù)(Kd)和親和常數(shù)(Kp)
●電好圖片&完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告,包括實(shí)驗(yàn)步驟、使用試劑、儀器、軟件檢索參數(shù)等