瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧及異常分析

跑電泳是分子生物學實驗的一項基本技術。只要做分子生物學方面的實驗，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。

跑電泳是分子生物學實驗的一項基本技術。只要做分子生物學方面的實驗，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。

跑電泳的材料是瓊脂糖，瓊脂糖凝膠電泳實驗常用以DNA 切膠回收，DNA 分離和用于佐證DNA 是否重組、質粒等是否切開。今天我們就來聊聊瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小細節(jié)。

1 凝膠制作

1．1 凝膠濃度 配制凝膠的濃度據(jù)實驗需要而變 ，一般在0．8％ ～2．0％之間，如果一次配制凝膠100 ml，沒用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會越來越高，導致實驗結果不穩(wěn)定，補水辦法：一是在容器上標記煮膠前的刻度，煮膠后補充相應的水分至原刻度；二是在煮膠前稱重，煮膠后補充水至原重量。粗略一點的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個經(jīng)驗補水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中，終濃度為0．5 t*g／ml；也可在電泳結束后染色。

1、2 梳板的選用 一般每個制膠模具均配有多個齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點樣孑L容積較大，用于DNA 片段回收實驗等；相反，梳齒窄而薄，形成的點樣孑L容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定，一般來說，上樣量小時盡量選擇薄的梳板制膠，此時電泳條帶致密清晰，便于結果分析。另外，每次制膠時都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，否則，拔梳板時易損壞凝膠孑L底層，導致點樣后樣品滲漏。當然，點樣孑L的破壞還與拔梳板的時間和方法有關，一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板，應急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右，拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢用力，因為有液體的潤滑作用，梳板易拔出且不易損壞點樣孑L。

2 點樣

點樣需加上樣緩沖液，因為上樣緩沖液中加了甘油或蔗糖增加密度，使樣品沉入孑L底；指示樣品的遷移過程，上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑，DNA染色劑是溴化乙錠，而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲存液一般為6× (10×)，表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時上樣緩沖液應稀釋到一倍濃度。點樣方法是將移液器基本垂直點樣孑L，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭(Tip)jian端進入點樣孑L即可將樣品注入孑L內(nèi)，千萬不可將Tip尖插至孑L底，并點上適合的DNA分子量標準，所謂適合是指樣品DNA分子量大小應基本在DNA分子量標準范圍之內(nèi)。

3 電泳

將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負極與負極相連，核酸帶負電荷，從負極向正極移動。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應相同，電泳緩沖液剛好沒過凝膠1 mm 為好，電泳緩沖液太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。電泳時凝膠上所加電壓一般不超過5 v／cm(指的是正負電極之間的距離，而不是凝膠的長度)，電泳時間一般為3O～60 min，根據(jù)實驗需要也可作適當調整，電壓增高，電泳時間縮短，核酸條帶相對來說不夠整齊，不夠清晰；相反，電壓降低，電泳時間較長，核酸條帶整齊清晰。另外，如果電泳后樣品泳動很慢或者沒泳動，請檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。

4 結果分析

較成功的電泳結果是分子量標準條帶整齊清晰，樣品條帶也整齊清晰，如果條帶模糊暗淡，單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說，可能的原因：溴化乙錠的質和量怎樣?溴化乙錠見光易分解，母液配制時間過長或保存不當(一般4℃ 避光保存一年內(nèi)有效)，或者終濃度沒達到0．5 vg／ml；電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過多，緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液，一般用2～3次就要更換，TBE緩沖液則可使用10次左右。

實際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)DNA 分子量標準小片段模糊不清，那足因為瓊脂糖凝膠濃度一般不會超過2 0％ ，較小的核酸片段在它的分辨范圍之內(nèi)，并且EB帶正電荷，電泳時會向負傲移動，如果將凝膠置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min，較小的片段則可重新染色：另外，溴化乙錠(EB)是一種中等強度誘變劑，操作過程中要戴手套，并將加有EB的染色液作好標記、妥善保存。

除這些細節(jié)之外，還有一些注意事項：

1. 酶切時所加的DNA 溶液體積不能太大，否則DNA 溶液中其他成分會干擾酶反應。

2. 酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1 小時*降解1 mg λDNA 的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA 不象λDNA 那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。

3. 市場銷售的酶一般濃度很大，為了省著點兒花，使用時可事先用酶反應緩沖液進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在10%以下，否則，酶活性將受影響。

4. 觀察DNA 離不開紫外透射儀，可是紫外光對DNA 分子有切割作用。從膠上回收DNA時，應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm），以減少紫外光切割DNA。

5. EB 是強誘變劑，還有中等毒性，就是有致癌性。配制和使用時都要戴好手套。盡量不要把EB 灑到桌面或地面上。如果真的不幸灑到桌面或地面上了，凡是沾污了EB 的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。

6. 當EB 放太多了，膠染色過深，DNA 帶看不清的時候，可將膠放入蒸餾水沖泡，30 分鐘后再觀察。

但有時候，跑電泳跑著跑著也會出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面，就談一談跑電泳的過程中可能會發(fā)生的異常現(xiàn)象，可能的原因，以及對策。