單克隆抗體藥物生產(chǎn)中細胞培養(yǎng)對抗體糖基化的影響

1986年，世界shouge單克隆抗體藥物——抗CD3單抗OKT3獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的上市批準(zhǔn)，單克隆抗體藥物產(chǎn)業(yè)化從此拉開序幕。作為主要應(yīng)用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領(lǐng)域的抗體類藥物，目前，全球已經(jīng)批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物超過了80個，年銷售額增長率超過30%，單克隆抗體在生物制藥領(lǐng)域發(fā)展得越來越快。隨著抗體工程的發(fā)展，嵌合單克隆抗體以及人源化單克隆抗體相繼問世，而以B淋巴細胞cDNA庫和噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展使全人源單克隆抗體成為可能，第一支全人源單克隆抗體——阿達木單抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批準(zhǔn)上市。全人源單克隆抗體具有良好的功效，且無fu作用，已成為當(dāng)前發(fā)展最迅速的一類單克隆抗體藥物。

單克隆抗體是蛋白類大分子，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，主要由Fab和Fc兩大功能區(qū)組成，在Fab段和Fc段特定的位點存在糖基化修飾。糖基化修飾形成的糖鏈僅僅占整個單克隆抗體的3%，盡管比例不高，但糖鏈結(jié)構(gòu)卻發(fā)揮著極其重要的作用：能夠維持抗體的空間構(gòu)象、穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu)，研究表明抗體脫糖基化后對熱的穩(wěn)定性大大降低；糖鏈結(jié)構(gòu)還能保護抗體不受某些蛋白酶水解；糖鏈中特別的糖型還與免疫效應(yīng)功能密切相關(guān)，糖型并非在人體內(nèi)生物合成，因此可能具有一定的免疫原性，可加速單抗的血漿清除。總的來說，糖基化修飾不僅對維持單克隆抗體的結(jié)構(gòu)有重要作用，同時一些特定的糖基化修飾類型以及不同的糖基化修飾程度均會影響抗體的安全性特征，而且，糖基化修飾也影響藥物的有效性。

單克隆抗體藥物的糖基化具有高度的異質(zhì)性，在單克隆抗體的糖基化中，由于糖基化種類的多樣性以及連接方式的多樣性，因而形成了自然界中最復(fù)雜和最多樣化的蛋白結(jié)構(gòu)。單克隆抗體藥物的糖基化結(jié)構(gòu)對于藥物的療效和安全具有重要意義。

圖1：IgG的結(jié)構(gòu)示意圖

有趣的是，盡管單克隆抗體藥物的輕鏈和重鏈的氨基酸序列是對稱的，但是Fc片段上N端糖基化修飾并非全部都為對稱。單抗藥物的N端糖基化修飾通常是復(fù)雜的雙天線糖鏈結(jié)構(gòu)，可能發(fā)生巖藻糖化和唾液酸化。通過表1，也可以看到單克隆抗體藥物常見糖基化修飾對抗體藥物結(jié)構(gòu)和功能有著很大的的影響。

表1：抗體藥物常見糖基化修飾及其對抗體藥物結(jié)構(gòu)和功能的影響

研究發(fā)現(xiàn)糖鏈中不同末端糖基化對IgG功能有不同的影響，IgG因不同的連接方式存在3種不同類型的N端糖型，分別為高甘露糖型、甘露糖雜合型、甘露糖復(fù)雜型，大多數(shù)的雜合型和復(fù)雜型存在核心巖藻糖基化，少數(shù)沒有。

圖2 3種不同類型的N端糖型

所以說單克隆抗體藥物糖基化對于其療效及生產(chǎn)就顯得極為重要，各大生產(chǎn)商都非常重視單克隆抗體藥物糖基化的質(zhì)量監(jiān)控。在抗體藥物生產(chǎn)過程中shouxuan哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中因其具有天然蛋白的加工機制，當(dāng)然也包括了抗體蛋白的糖基化修飾，這樣所生產(chǎn)出來的單克隆藥物就與天然的蛋白十分接近，并且保證了治療效果。單克隆藥物的糖基化修飾主要是由寡糖連接到天冬酰胺的側(cè)鏈，即N-連接，或者連接到絲氨酸/蘇氨酸連接，即O-連接，如上文中提到的連接形式及種類。N端或者O端的多糖會影響單克隆抗體藥物的蛋白活性，同時也決定了此種單克隆抗體藥物在體內(nèi)的半衰期。正是因為這些特點，抗體藥物的糖型及糖基化修飾備受藥品監(jiān)管部門的重視，力求達到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確保其有效性和安全性。

在細胞培養(yǎng)過程中，決定單克隆抗體糖基化的主要因素有細胞表達系統(tǒng)、培養(yǎng)模式、生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基等，這幾個方面都會改變抗體糖基化修飾，對單克隆抗體研究及生產(chǎn)等相關(guān)研究帶來了巨大挑戰(zhàn)。表2列舉了細胞培養(yǎng)過程中影響抗體蛋白糖基化的各種變量。 

表2 細胞培養(yǎng)過程中影響抗體蛋白糖基化的變量匯總

接下來我們將重點對細胞表達系統(tǒng)、培養(yǎng)模式、 生產(chǎn)工藝、 培養(yǎng)基等影響蛋白藥物糖基化的研究進行總結(jié)。

2.1 表達系統(tǒng)對抗體藥物糖基化修飾的影響

在抗體藥物研發(fā)階段，研究細胞表達系統(tǒng)對糖基化的影響十分關(guān)鍵。目前，商業(yè)化生產(chǎn)抗體藥物的細胞表達系統(tǒng)主要是CHO細胞，少部分使用SP2/0、人纖維肉瘤細胞、人類淋巴母細胞、小鼠骨髓瘤細胞等。有報道表明CHO懸浮細胞表達人β-干擾素與微載體貼壁CHO細胞表達的干擾素具有相同的糖型。由相同組織分離的細胞表達的功能性酶種類也是多樣化的，從而表達糖基化蛋白的能力也不同。CHO細胞中CHO-K1和 DUKX-B11都含有未激活的α(1,3)GalT基因，同樣都有低水平的NGNA，CHO細胞表達系統(tǒng)在生產(chǎn)抗體藥物時對糖基化修飾的影響是zui普遍的。

CHO細胞表達糖基化的機制同人類的IgG糖基化作用機制十分相似，僅有一些微小的不同之處。據(jù)報道，人的IgG末端唾液酸殘基以α-2,6連接，CHO細胞來源的抗體以α-2,3連接。無論是人的IgG，還是CHO細胞表達來源的抗體，末端唾液酸殘基的含量都很低。因此，唾液酸殘基連接的不同對產(chǎn)品的質(zhì)量可能不會造成影響。而且，許多人類血清糖蛋白也含有α-2,3連接的唾液酸殘基。

因此可見，宿主細胞系極大地影響了單克隆抗體的糖基化修飾類型，進而影響單克隆抗體治療相關(guān)的安全性。對于生物制藥產(chǎn)業(yè)來說，選擇合適的宿主細胞系可以優(yōu)化并控制糖基化修飾，進而提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

2.2 培養(yǎng)模式對抗體藥物糖基化修飾的影響

細胞培養(yǎng)方式常見的有三種：批次培養(yǎng)、分批補料培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)。不同的細胞培養(yǎng)方式會明顯影響單克隆抗體藥物的糖基化修飾，在灌流培養(yǎng)模式下糖基化總體水平較分批補料培養(yǎng)模式下的唾液酸化有所增加。總體來說，連續(xù)灌流培養(yǎng)的糖基化程度較批次培養(yǎng)要高，而批次培養(yǎng)模式下的細胞增長速度快，灌流培養(yǎng)模式下細胞生長速度越慢糖基化程度越高。當(dāng)然選擇哪一種培養(yǎng)方式取決于所生產(chǎn)的抗體藥物自身糖基化情況。