蛋白表達實驗過程可能遇到的常見問題分析

　　一、蛋白不表達或表達量很低？

　　1.選擇正確的表達載體和表達菌株

　　T7啟動子的載體應選用BL21（DE3），BL21（DE3）pLysS，Transetta（DE3）等菌株。非T7啟動子的表達載體應選用BL21表達菌株。

　　2.嘗試不同的表達載體與菌株

　　不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一表達蛋白無法通過優化誘導表達條件得到明顯改善，可以更換其他菌株或表達載體。

　　3.表達條件的優化

　　選擇不同的培養基。對于某些蛋白，在培養基中加入適量的葡萄糖（0.1%-0.5%），可以明顯提高表達量。

　　較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間，一般可以加快表達的速度，促進目的蛋白的積累，從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量，形成包涵體。

　　細胞的生長狀態對蛋白表達有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監測生長狀態。對于大部分蛋白，應在菌株的對數生長期（OD600=0.5）進行誘導。

　　二、目的蛋白大小不正確？

　　蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響。可以通過加熱變性蛋白，從而準確判斷蛋白大小。確認蛋白表達是否完整，蛋白是否提前終止表達。若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白打開二硫鍵（加入DTT、β-ME等還原劑）等手段，破壞次級結構，準確判斷分子量大小。