單克隆抗體制備過(guò)程詳解

　　單克隆抗體制備需要篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。

　　單克隆抗體制備過(guò)程：

　　1）免疫脾細(xì)胞的制備制備單克隆抗體的動(dòng)物多采用純系Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

　　2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過(guò)含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性（恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

　　3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵：

　　1.技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒(méi)有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

　　2.融合試驗(yàn)失敗的原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無(wú)菌操作技術(shù)。

　　4）陽(yáng)性克隆的篩選應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作一次檢測(cè)，過(guò)早容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。檢測(cè)方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡(jiǎn)便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法簡(jiǎn)便，RIA法準(zhǔn)確。陽(yáng)性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽(yáng)性時(shí)才確定為陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。

　　5）克隆化克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。克隆化應(yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。克隆化的方法很多，而常用的是有限稀釋法。