X-射線晶體學

技術介紹：

X-射線分辨單克隆抗體-抗原復合物是分析單克隆抗體識別表位的可靠方法，該方法基于對單克隆抗體-抗原共晶體衍射的X-射線束的強度和角度測量，再用生物信息學的方法確定原子坐標，將復合體的三維結構完整可視化。

抗原表位分析對抗體人源化改造，抗體親和力提高，抗體穩定性改造，發現新的功能表位，改變抗體特異性，設計新抗體，基于抗原－抗體相互作用的立體構型設計新型功能分子改造抗體都很重要。

應用該方法首先需獲得純度較高的抗原、抗體，并使其相互作用形成共晶，但由于成本及技術要求較高，難以建立結晶條件，某些細菌或病毒蛋白產量過低等原因，此方法并未廣泛使用。

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生物物理技術在表位作圖中的應用：

X-射線衍射、冷凍電鏡(cryo-EM)、核磁共振(NMR)、質譜(MS)和表面等離子體共振(SPR)等生物物理技術在利用單抗的B細胞表位作圖研究中均發揮了重要作用。利用這些技術，不僅可以鑒定到構象性B 細胞表位，也可以鑒定線性B細胞表位。抗原-單抗復合物的 X-射線晶體學分析是目前準確的B細胞表位鑒定方法。

它可以精確地確定抗原分子中與單抗發生相互作用的氨基酸殘基，甚至可以定位抗原上被單抗識別并結合的氨基酸殘基的主鏈或側鏈原子。不論被單抗識別的是構象性B細胞表位，還是線性B細胞表位，都可以通過抗原-單抗復合物的X-射線晶體學分析得到解析。

由于抗原-單抗復合物的 X-射線晶體學分析涉及抗原和單抗的純化、抗原-單抗復合物的形成與純化以及復合物的晶體學解析等，需要專業技術和大量資金支持；這對于一些可溶性的簡單抗原來說就常常是一項難以完成的任務，而對于許多復雜抗原(如膜蛋白)而言則更加困難。因此，雖然目前已經鑒定到成千上萬的單克隆抗體，但只有少數 B 細胞表位通過抗原-抗體復合物的X-射線晶體學分析方法得到解析。

由于需要對樣品進行衍生和干燥，電子顯微鏡不適于研究抗原-單抗間的相互作用。但自2013 年冷凍電鏡技術的建立使電鏡技術研究抗原-單抗復合物的結構成為可能。由于冷凍電鏡技術僅需要少量抗原-單抗復合物，不需要高純度蛋白，也不用對復合物進行結晶，可以用于分析其它方法(如X-射線晶體學技術)無法解析的大分子復合物的結構，因此，冷凍電鏡技術在表位作圖方面比 X-射線晶體學技術更具優勢。

目前，冷凍電鏡技術常與X-射線晶體學技術相結合應用于B細胞表位作圖研究。單獨或與X-射線晶體學技術相結合，冷凍電鏡技術已經用于 HIV、HPV 等病毒結構蛋白的B細胞表位作圖研究。第三種應用于利用單抗的B細胞表位作圖研究的生物物理技術是核磁共振技術。

核磁共振技術的分辨率恰好適合在原子水平解析抗原-抗體復合物中相互作用界面的結構信息，即 B細胞表位鑒定。該方法通過分析抗原本身與抗原-單抗復合物核磁共振信號的差異，可以快速、準確地確定抗原的B細胞表位氨基酸基序。基于核磁共振技術的B 細胞表位作圖可以提供比突變體肽庫或肽庫篩選技術更詳細的表位信息，同時又比X-射線晶體學技術更加快速。但是，利用核磁共振技術解析抗原的B細胞表位需要首先確定抗原中每個氨基酸殘基的核磁共振信號，這對于大分子抗原來說是一個很大的挑戰。

核磁共振技術單獨或者與其他方法相結合已成功用于多種病原微生物結構蛋白的 B細胞表位作圖研究。質譜也以其快速的優點而廣泛用于B細胞表位的鑒定。在該方法中，首先在抗體存在或不存在條件下，以蛋白酶酶解抗原蛋白，然后利用質譜分析經分離純化的酶切產物，從而確定被抗體保護的抗原蛋白的邊界(表位區域) 。

這種B細胞表位作圖方法的不足之處在于其只能鑒定到30−60個氨基酸殘基的表位片段，不能進行表位的精確定位。雖然氕/氘交換-質譜技術提高了其表位作圖的精確度，但仍低于基于X-射線晶體學技術和冷凍電鏡技術的表位作圖方法的精確度。經過 25 年的發展，隨著樣品處理技術的提高和*質譜儀的問世，基于質譜技術的 B 細胞表位作圖所需的樣品量更低，可以在不降低準確性的前提下分析更加復雜的抗原樣品。

基于質譜技術的 B 細胞表位作圖方法不再僅限于利用單克隆抗體的表位鑒定，已經擴展到利用多克隆抗體的 B 細胞表位作圖。表面等離子共振技術近年來迅速發展并應用到生物分子相互作用的研究領域。該技術不僅具有無需標記、特異性強、靈敏度高、樣品用量小的優點，而且可實現在線連續實時檢測。

基于表面等離子共振技術的 B 細胞表位作圖類似于ELISA技術，雖然其B細胞表位作圖的分辨率低于基于 X-射線晶體學技術和冷凍電鏡技術的表位作圖方法的分辨率，但其可以快速、高通量地進行系列抗原突變體或片段與單抗的結合能力的分析。表面等離子共振技術單獨或與噬菌體展示技術等其它B細胞表位作圖技術結合已經用于多種抗原分子的 B 細胞表位作圖研究。

綜上所述，基于生物物理技術的利用單抗的B細胞表位作圖雖然都可以進行B細胞表位鑒定，但這些方法都需要昂貴的儀器，有的還需要抗原-抗體復合物的晶體結構信息或者需要專業技術人員的輔助才能完成。因此，X-射線晶體學技術、冷凍電鏡技術和核磁共振技術更多地用于重要病原的中和性單抗識別的B細胞表位鑒定，它們都是B細胞表位作圖方法的重要組成部分。

公司優勢：

目前有幾種方法用于抗原表位的分析：X-射線晶體學、噬菌體呈遞展示隨機肽庫、LC-MS分析、3D-EM分析等；其中X-射線晶體衍射的方法是精確的方法，通過抗原-抗體共結晶的方法可以精確到原子級別。

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