重組質(zhì)粒構(gòu)建與基因打靶

1.            質(zhì)粒構(gòu)建

流程：

1. 目的基因的PCR擴(kuò)增

2. PCR產(chǎn)物純化

3. 載體和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切

4. 膠回收

5. 載體與目的基因的連接

6. 轉(zhuǎn)化

7. 菌落PCR鑒定

8. 重組質(zhì)粒的抽提

2.            基因打靶（gene targeting）

基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干(ES) 細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上，通過對(duì)生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點(diǎn)突變引人、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達(dá)突變的性狀，從而可以研究基因功能等生命科學(xué)的重大問題，以及提供相關(guān)的疾病治療、新藥篩選評(píng)價(jià)模型等。外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，整合在預(yù)定位點(diǎn)，改變細(xì)胞遺傳特性的方法。建立在胚胎干細(xì)胞與同源重組的基礎(chǔ)之上。是一種定向改變生物遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。

實(shí)驗(yàn)原理：首先獲得ES（胚胎干細(xì)胞） 細(xì)胞系，利用同源重組技術(shù)獲得帶有研究者預(yù)先設(shè)計(jì)突變的中靶ES 細(xì)胞。通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經(jīng)過遺傳修飾的ES 細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。經(jīng)過遺傳修飾的ES 細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使得經(jīng)過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。獲得的帶有特定修飾的突變動(dòng)物提供研究者一個(gè)特殊的研究體系，使他們可以在生物活體中研究特定基因的功能。

基因打靶的方式：全基因打靶、條件性打靶、誘導(dǎo)性打靶、組織特異性打靶和基因捕獲打靶等。

主要步驟：

1. 打靶載體的構(gòu)建

2. 導(dǎo)入：顯微注射法（常用），電穿孔法，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等；受體細(xì)胞一般采用胚胎干細(xì)胞（ES）

3. 篩選: (G418和GANC培養(yǎng)基)

a) 正負(fù)選擇系統(tǒng)（G418R/GANCR）

b) 正向選擇法

4. PCR進(jìn)一步鑒定

5. 打靶ES細(xì)胞導(dǎo)入囊胚

6. 囊胚植入假孕母鼠子宮發(fā)育