噬菌體展示技術(shù)之抗體親和力成熟

近年來，隨著抗體藥物的廣泛上市，抗體已經(jīng)取代基因治療成為生物制藥領(lǐng)域的主要生力軍。而抗體在疾病診斷、治療和預(yù)防方面的作用很大程度上取決于其親和力的高低，隨著抗體工程技術(shù)的不斷發(fā)展，如何提高抗體親和力已成為抗體工程的難題之一。圍繞這一問題人們已經(jīng)從不同的角度展開了研究，例如，提高抗體庫的質(zhì)量、增加抗體庫的多樣性、進行抗體重鏈或輕鏈的替換以及點突變有目的進行氨基酸替換等都能不同程度地提高抗體親和力。

抗體親和力表示抗體與抗原結(jié)合能力的大小?？贵w親和力成熟是指機體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。

噬菌體展示技術(shù)作為一種*的抗體庫構(gòu)建技術(shù)能結(jié)合多種技術(shù)手段，于體外實現(xiàn)抗體的親和成熟，并配合親和篩選方法獲得具有高親和力的抗體。在噬菌體抗體展示技術(shù)中，VH和VL基因的隨機重組，在一定程度上模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程。如果結(jié)合其它技術(shù)則可以使抗體的親和力提高到一個更高的層次，下面介紹一些抗體親和力成熟的方法。

體外抗體親和力成熟的幾種策略

要想實現(xiàn)抗體的親和力體外成熟，就必須充分地了解天然抗體的親和力體內(nèi)成熟原理，設(shè)計模擬體內(nèi)可能出現(xiàn)和存在的變化，從而促進抗體的體外進化。

天然抗體的親和力成熟可以分為體細胞高頻突變和克隆選擇兩個過程。在天然抗體親和力成熟的過程中，抗原刺激下的體細胞高頻突變有著舉足輕重的作用，因此親和力體外成熟的策略也多在抗體基因突變水平上，即采用各種突變方法來模擬體內(nèi)的高頻突變。

1. 隨機突變

（1）錯配PCR

通過改變PCR反應(yīng)條件，提高核酸錯配率將隨機突變引入基因序列。該技術(shù)可以通過提高鎂離子濃度、加入錳離子、失衡4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）濃度、使用低保真DNA聚合酶等方法，來提高抗體基因的突變率。

除此之外，突變率的高低也可以采用改變模板DNA 的復(fù)制次數(shù)進行控制。復(fù)制次數(shù)越多，突變率將累積得越高。理論上經(jīng)過多輪的PCR反應(yīng)可獲得0.15%~3%的突變頻率，再用突變的抗體基因庫建立噬菌體抗體庫，最后從中篩選高親和力抗體。噬菌體展示技術(shù)有效的改善了使用錯配PCR技術(shù)導(dǎo)致的抗體親和性和特異性的喪失，以及有效突變體過少的問題。

（2）DNA改組

DNA改組技術(shù)是對同源的抗體基因，采用脫氧核糖核酸酶Ⅰ將其切割成不超過50 bp的片段，再隨機組合后進行PCR擴增成完整的抗體基因。它包含了抗體片段隨機化切割、重組和篩選的過程，一定程度上模擬了天然抗體的親和力成熟過程，并加快了體外定向進化速度。采用連續(xù)多輪的DNA改組具有去除有害突變優(yōu)勢。另外，DNA 改組獲得的突變體，突變位點可以位于非抗原直接接觸的區(qū)域，有擴大庫容的作用。

（3）鏈改組

鏈改組即鏈替換技術(shù)，是固定抗體的一條輕鏈或重鏈不變，而將另一條重鏈或輕鏈經(jīng)過突變處理后，重新與固定鏈配對，以提高抗體親和力的方法。 該方法保留一條鏈不變，目的是為了保持抗體的特異性，而將經(jīng)過突變處理的另一條鏈與其配對，是為了增加抗體的親和力，以篩選到更高親和力的抗體，重復(fù)進行鏈替換和親和力篩選將產(chǎn)生更高親和力的抗體。

將噬菌體展示技術(shù)與此技術(shù)結(jié)合構(gòu)建次級抗體庫將使該法更便利。鏈改組技術(shù)能有效提高抗體親和力，但如果無法明確了解zhiding抗原的基因結(jié)構(gòu)，或者抗體基因片段未能擁有一個比較完整的初級抗體庫，則不適合使用鏈改組技術(shù)。

（4）突變株

Escherichia coli MutD5 是常用的大腸埃希菌突變株，該菌株可以校對和復(fù)制后錯配修復(fù)缺陷，產(chǎn)生高頻率的單個堿基替換，突變率高于普通菌株105倍。突變株法的優(yōu)勢是突變發(fā)生在轉(zhuǎn)化宿主菌后，而其他方法的突變均發(fā)生于轉(zhuǎn)化之前，而轉(zhuǎn)化效率是限制大容量突變庫構(gòu)建的關(guān)鍵因素之一。使用突變株法可以構(gòu)建庫容為1012 - 1014個克隆的超大容量抗體庫，利用噬菌體展示技術(shù)篩選高親和抗體，通過該法的可以獲得一些未能在定向突變中獲得的突變體。但是該方法較難對突變率進行控制，且獲得的隨機突變也可能發(fā)生于載體部分，造成有害突變。

2. 定向引入突變

CDR重組

由于天然抗體在親和力成熟過程中，體細胞高頻突變發(fā)生區(qū)域并非均勻分布，而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR(complementarity-determining region,CDR)區(qū)。這樣既可以獲得足夠的序列多樣性，又不會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此在抗體的親和力體外成熟中，CDR 區(qū)是最常選用的定點突變區(qū)域。

CDR重組技術(shù)即將多種突變或經(jīng)過設(shè)計的DNA序列引入抗體多個CDR區(qū)，再利用抗體庫技術(shù)將這些CDR區(qū)進行多次重組，已達到親和成熟的目的。該技術(shù)使噬菌體展示技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用，并且相對于熱點突變其能更完整的模擬體內(nèi)抗體輕鏈與重鏈重排的整個過程，該方法可結(jié)合多種技術(shù)使用。

除了CDR區(qū)突變外，天然抗體親和力成熟中的突變熱點也是常見的定點突變位點。這些熱點通常包含或接近AGY和RGYW（R = A or G；Y = C or T；W = A or T）序列。

基因工程抗體親和力成熟的過程其實就是一個體外的分子進化，多樣化的選擇和擴增的過程。根據(jù)對抗體親和力成熟的認知，各種模擬體細胞高頻突變有效引入突變的策略是親和力成熟的核心，而基于不同原理的突變策略的組合應(yīng)用可能對基因工程抗體的親和力成熟有協(xié)同增強的作用。研究基因工程抗體的親和力成熟，制備得到高親和力的抗體，可以幫助我們在臨床上使用低劑量達到我們需要的生物學效應(yīng)，減少劑量導(dǎo)致的毒性反應(yīng)，增加治療效果，在抗體藥物研發(fā)進程中至關(guān)重要。