百花齊放的單細胞分析技術

世界上沒有*相同的兩片樹葉，世界上也沒有兩個相同的細胞，單個細胞都是dute的，它們在大小、蛋白質水平和所表達的RNA轉錄子方面都可能相差甚遠。單細胞分析（Single Cell Analysis ，SCA）即是對單個細胞進行研究，研究單個細胞不僅可以很好的認識到細胞異質性，而且可以更好的對疾病進行解讀。

單細胞分析技術飛速發展，這都多虧了分析工具的快速發展，如細胞分離、微流體、單細胞測序等。目前，單細胞分析的應用已涉及多個的領域，包括基礎研究型應用，如癌癥、免疫學、干細胞等；臨床應用，如無創產前診斷、體外受精、循環腫瘤細胞（CTCs）等。

單細胞基因組旨在通過組學方法研究單個細胞。近年來隨著技術的發展，這一年輕的領域正在迅速成熟起來。單細胞基因組研究的前身可以追溯到用芯片檢測單細胞的基因表達。不過，新一代DNA測序才是單細胞基因組學的大功臣，這些技術的出現讓單細胞基因組研究最終一飛沖天。如今，單細胞RNA-seq已經成為了成熟的日常操作，其他形式的單細胞分析開始百花齊放，包括單細胞分離和捕獲以及單細胞的DNA、蛋白質、染色質修飾等等。

1.單細胞分離和捕獲

單細胞分析的第一步是細胞捕獲和分離，單細胞的獲取，最初是通過梯度稀釋的方法，既繁瑣也容易污染；隨后通過顯微操作方法，用類似注射器的裝置分離單細胞，或激光捕獲顯微切割技術（LCM），然而可操作性并不強；再往后，流式細胞儀的分揀成為常用的單細胞分離方法，但對環境要求過高；近年來微流控技術的發明，逐步成為研究者們的選擇,不僅減少了昂貴試劑的使用量，節約了成本，還提高了操作效率和靈敏度。

2.單細胞DNA測序

單細胞全基因組DNA測序是一項富有挑戰性的工作，由于在單細胞中的DNA和RNA的數量非常小（一個典型的人類細胞僅含有約6.6pg DNA、10pg總RNA。）用傳統的測序儀無法檢測，所以科學家們必須首先對這些分子進行擴增，同時盡量的減少錯誤。

單細胞測序技術(Single-CellSequencing)是在單細胞水平對基因組進行擴增與測序的技術。目前的全基因組擴增技術主要有三種：簡并寡核苷酸引物PCR擴增（DOP-PCR），多重置換擴增（MDA）；和基于多次退火和成環的擴增循環（MALBAC）。市場上有很多種擴增試劑盒，去年華大基因的研究人員在《GigaScience》發表了文章，利用7種試劑盒開展單細胞全基因組擴增，系統地比較了不同WGA方法的優點和缺點，尤其關注變異檢測。結論是: 對于那些需要低重復率和高基因組覆蓋度的研究，如疾病研究中的SNV檢測， MDA和MALBAC策略比較合適。

此外，如果同時開展SNV和CNV檢測，他們建議使用MDA-2和/或MALBAC，因為它們在變異檢測上的效率和準確性更高。不過，若有大量細胞需要擴增，成本是必須考慮的因素。MDA和DOP-PCR是常用的全基因組擴增方法，成本相對較低。相比之下，MALBAC的成本要更高一些，且相對來說操作更為復雜。在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進行系統的比對。The Scientist雜志聯系了單細胞研究領域的一些專家，請他們分享了在單細胞中進行轉錄研究的秘訣，比較了一些常用的單細胞測序技術，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

霍華德休斯醫學研究所的科學家們對人類大腦皮層神經元進行了單細胞測序，并根據發育過程中累積的體細胞突變重建了神經元譜系。他們的研究顯示，正常成年人的單個大腦神經元具有一千多個點突變，而且不同神經元的突變形式并不相同。大多數突變發生在大腦發育完成之后，是基因積極活動時產生的。

3.單細胞數據分析

單細胞基因組技術正在迅猛發展，單細胞計算分析也在奮起直追。統計和計算方法是單細胞基因組研究的核心，只有正確的方法才能幫助我們從數據中提取有意義的生物學信息。前不久，德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的研究人員開發了shouge用于單細胞DNA測序的突變檢出程序——Monovar。這一重要研究成果于發表在Nature Methods雜志上。研究人員認為Monovar是單細胞測序評估SNV的一大進步，能夠為人們提供多種疾病的關鍵信息。精確檢測SNV對于癌癥診療、個性化醫療和產前診斷非常重要，而Monovar在這些方面有著廣闊的應用前景。

4.單細胞蛋白質分析

談到單細胞蛋白質分析，我們不能不提質譜流式細胞技術（mass cytometry）。這種技術是流式細胞技術與質譜分析技術相結合產生的結晶，利用質譜原理對單細胞進行多參數的檢測。它繼承了傳統流式細胞儀的高速分析的特點，又具有質譜檢測的高分辨能力，是流式細胞技術一個新的發展方向。質譜流式細胞技術能在單細胞水平上同時分析超過40種細胞參數，極大的增強了流式細胞分析評估復雜細胞系統和過程的能力。Cell雜志發表的“Mass Cytometry: Single Cells, Many Features"綜述，全面介紹了質譜流式細胞技術的現狀，相關儀器，主要應用范圍，數據分析方法，以及未來的發展前景。

5.單細胞表觀遺傳學分析

表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等。比較通俗的講表觀遺傳學是研究在沒有細胞核DNA序列改變的情況時，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。表觀遺傳學修飾可以在不改變DNA序列的情況下調控基因的活性，對于人類發育、人類疾病和環境影響有深遠的意義。DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學修飾，廣泛參與了細胞對基因表達的控制，在細胞生長、細胞分化、細胞增殖和疾病狀態中起到了關鍵性的作用。2014年7月，Nature Methods雜志發布了單細胞重亞硫酸鹽測序（scBS-seq）技術。該技術可以對單個細胞的所有DNA甲基化進行全基因組分析，幫助人們進一步理解胚胎的發育機制，更好的進行癌癥等治療。

通過單細胞分析來檢測表觀遺傳學（epigenetics）狀態是單細胞研究的一大趨勢。DNase I超敏感位點（DHS）是對DNaseⅠ高度敏感的活性染色質區域。哺乳動物細胞的DHS定位，能夠提供轉錄調控元件和染色質狀態的重要信息，一直是科學家們的研究熱點。DNase測序（DNase-seq）是進行全基因組DHS分析的常用方法，不過DNase-seq需要數百萬細胞，大大限制了該技術的應用范圍。美國NIH的趙可吉博士開發了在單細胞中檢測全基因組DHS的超靈敏策略，并將其命名為單細胞DNase測序（scDNase-seq）。

總結：單細胞分析技術飛速發展，但目前來看，還處在初級階段，我們相信：在單個細胞層面我們將以*的水平理解基因組學，表觀基因組學和轉錄組學的多樣性，推動基礎研究和臨床研究的快速發展。