【干貨分享】細胞轉(zhuǎn)染攻略

轉(zhuǎn)染（Transfection） ，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。

轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。

一

轉(zhuǎn)染的類型

1）根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。

2）根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學，生物，物理方法。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法簡單快捷且不需要其他儀器輔助的綜合考慮，一般是實驗室的常客，所以接下來先給大家介紹細胞轉(zhuǎn)染常用的方法-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和操作步驟。

二

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理

脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。

優(yōu)點:

與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性，它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟

進行實驗之前，請先規(guī)劃好實驗，一般細胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量，并確認準備好所需試劑：Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，以及DNA，這個一定要確認好。

1、細胞鋪板

（1）一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次（匯合率達到90%之前對細胞進行傳代，不要長到100%），從解凍過程中恢復過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉(zhuǎn)染，傳代次數(shù)高(>30-40)時，細胞的生長速度和形態(tài)會改變。

（2）如果提總蛋白，一般選擇六孔板進行轉(zhuǎn)染，因為轉(zhuǎn)染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。

（3）傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)。

（4）轉(zhuǎn)染當天，將細胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降，如果是簡單細胞系的轉(zhuǎn)染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，細胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%（這個前提是轉(zhuǎn)染24h，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%），細胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進行。

2、細胞轉(zhuǎn)染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準備轉(zhuǎn)染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒；B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成*培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時（不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前，應該摸一個最佳配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率）。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。

轉(zhuǎn)染時，應使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度，測得的OD值應介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。

2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞有很大的毒性作用。

轉(zhuǎn)染時，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質(zhì)體失效。

血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對此敏感的細胞會受到損傷，甚至死亡（比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞）導致轉(zhuǎn)染效率極低。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，但是血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復合物的形成，在DNA-轉(zhuǎn)染復合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基，因為lipo2000具有一定毒性。

細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預防污染，但是抗生素可能對轉(zhuǎn)染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預防污染的抗生素，就會影響轉(zhuǎn)染，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒，但當轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性時，就會使抗生素也進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的*培養(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。

3、觀察轉(zhuǎn)染的效果

在轉(zhuǎn)染后24小時，用熒光顯微鏡觀察實驗結果并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來對照，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同時用Q-PCR和者WB來檢測。

轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以通過兩種方法：

1、復轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進行轉(zhuǎn)染，前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。

2、通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。

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無細胞系統(tǒng)蛋白表達服務(Protein Expression in Cell-Free System)

服務簡介

無細胞表達系統(tǒng)是一種以外源DNA或mRNA為模板， 利用細胞抽提物中的細胞合成機器,白折疊銦子及其他相關酶系,通過添加氨基酸和T7聚合酶和能量物質(zhì)來實現(xiàn)蛋白表達的體外系統(tǒng)。中包括真核無細胞表達系統(tǒng)和原核無細胞表達系統(tǒng)。無細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢

更快得到數(shù)據(jù):僅需1小時即可獲得功能蛋白，而基于細胞的吊打系統(tǒng)則需要數(shù)天。

節(jié)省時間:表達蛋白可以直接用于后續(xù)實驗，不需要額外純化。

更適用于激酶等毒性蛋白的表達、也可使用經(jīng)過修飾的tRNA來進行標記，在某特定位點摻入天然的氨基酸。

一個系統(tǒng)，多重應用:表達的蛋可于白-伯互作實驗;白核酸互作實驗，白修飾等多種特征分析。

艾柏森生物無細胞表達系統(tǒng)服務流程

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