噬菌體的分離與純化

實驗原理

噬菌體感染宿主細胞后，其DNA(或RNA)在細胞體內進行復制、轉錄，相關基因表達，裝配成完整的噬菌體顆粒，最后裂解宿主細胞或通過擠出方式從宿主細胞(宿主細胞不被殺死，如M1噬菌體)中釋放出來。因此，①在液體培養基中可使渾濁的菌懸液變為清亮或較清亮。利用噬

菌體的這種特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養基混合后培養，噬菌體便能大量增殖，釋放，從而可分離到特定的噬菌體。②在有宿主細菌生長的軟瓊脂平板上，噬菌體可裂解細菌或限制被染細菌的生長，形成透明的或渾濁的空斑，亦稱噬菌斑。--個噬菌體產生一個噬菌斑，利用這種現象可將分離獲得的噬菌體進行純化。

三、實驗用具及材料

1.菌種:大腸桿菌

2.試劑:氯仿

3.培養基:

液體牛肉膏培養基:胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g,NaCl 1g，加H20至200mL，pH7. 4，121 °C20min 高壓滅菌。

3X牛肉膏培養液:胰蛋白陳3g，牛肉膏0. 9g,NaCl 1.5g， 加H20至100mL，pH7. 4，121 °C20min 高壓滅菌。

固體牛肉膏培養基:每100mL液體牛肉膏培養基加入1.5g瓊脂粉，121 °C20min高壓滅菌。

半固體牛肉膏培養基:每100mL液體牛肉膏培養基加入0. 7g瓊脂粉，121 °C20min高壓滅菌。

4.儀器及其他用品:無菌小試管、無菌吸管、玻璃涂棒、無菌細菌過濾器(孔徑0.22um)，恒溫水浴鍋等。

5. 陰溝污水

四、實驗步驟

1.噬菌體的分離

(1)制備菌懸液:用接種環在斜面.上挑取少許大腸桿菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培養液的試管中,混合均勻后置37°C培養過夜

(2)增殖培養:在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液體培養基大的三角燒瓶中加入陰溝污水20mL和大腸桿菌過夜培養物0.3mL，混合后置37C振蕩培養12~24h

(3)制備裂解液:將上述混合培養物倒入一支50mL無菌離心管中，經4000r/min離心15min;將上清液小心的轉入另一無菌離心管中，所得裂解液經37°C培養過夜，以作無菌檢查，此為噬菌體裂解液;還可加入幾滴氯仿，稍作混合，備用

(4) 噬菌體檢測:在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板.上加入0.1mL大腸桿菌菌液，用無菌玻璃涂棒將菌液均勻地涂布在培養基表面.上。待平板菌液干后分別滴加數小滴裂解液于其上，置37°C培養過夜。如果滴有裂解液處形成無菌生長的透明或渾濁噬菌斑，便證明裂解液中有大腸桿菌噬菌體

2. 噬菌體的純化

(1)取_上經證實的噬菌體裂解液0.1mL于- -支無菌試管中，再加入0.1mL新鮮的大腸桿菌培養物，混合均勻;

(2)取_上層瓊脂培養基溶化并冷卻至55°C (可預先溶化后置50~55°C水浴鍋內保溫備用)，加入0.2mL上述噬菌體與細菌的混合物，混勻后快速倒入含地層培養進的平板上，鋪勻，置37°C培養24h;

(3)取出培養的平板仔細觀察平板上噬菌斑的形態特征(如噬菌斑形狀、大小、清亮程度等)。此過程制備的裂解液中往往有多種噬菌體，需進一步純化;

(4)純化時，通常采用接種針在單個噬菌斑中刺一.下，蘸取少許噬菌體接入含有大腸桿菌的液體培養基中,置37°C振蕩培養，直至試管中菌懸液由渾濁變清;培養物經離心后取上清液，再重復步驟(2)、(3)直到出現的噬菌斑形態一致為止

五、實驗結果

仔細觀察和比較平板上出現的不同噬菌斑的形態特性并繪圖

六、注意事項

1.使用儀器要保證是無菌的;

2.注意瓊脂的濃度;

3.氯仿是易燃品，應遠離火焰

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根據客戶提供樣品主要進行如下實驗流程:

●抗體庫的滴度測定:取少量上述獲得的噬菌體ScFv抗體庫,梯度稀釋后進行噬斑培養實驗,觀察噬斑生長情況以判斷噬菌體ScFv抗體庫的滴度;

●噬菌體抗體庫的富集篩選:使用靶標抗原包被酶聯板,加入噬菌體抗體進行孵育,隨后進行洗板、洗脫;將洗脫下來的噬菌體抗體進行中和后，再次感染細菌，并進行第二輪的淘洗; 共進行3輪淘洗,每一輪洗脫后都進行滴度測定;后-輪篩選時,設BSA包被的對照組以確定是否富集了大量抗BSA的噬菌體抗體。

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