scFV/Fab構建

技術背景：

單鏈抗體（single-chian variable fragment，scFv），是由抗體重鏈的可變區與輕鏈的可變區在一段肽鏈連接下構成的小分子，是具有抗體活性的小結構功能結構單位；單鏈抗體可以由表達系統進行表達，也可以用噬菌體展示技術進行制備，由于其分子量小，穿透力強，半衰期短，免于抗原性低等等特點，所以在臨床診斷，治療，預防方面有重要作用和廣闊的應用前景，本文就單鏈抗體結構，制備，應用等方面做一個概述。

scFv結構，完整的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，透過人工改造，可使其直接表達可變區，通過人工合成的鏈接肽基因將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區連接成重組基因，由該重組基因表達的抗體就稱之為單戀抗體，結構上，可將重鏈的N端與輕鏈的C端相連，也可以將輕鏈的N端與重鏈的C端相連，鏈接肽長度通常為15-25個氨基酸，通常由甘氨酸和絲氨酸構成，具有一定的彈性以及蛋白酶抗性，作用是鏈接重鏈輕鏈，并且保持一定的彈性，使重鏈輕鏈結合后仍然可以配對，構成單價抗原結合位點。

Fab片段（Fragment of antigen binding）也叫做抗原結合片段，是抗體結構筑龍可以與抗原結合的區域，由一條完整的輕鏈與重鏈的VH與CH1結構域組成，分子量約為5X104   輕鏈與重鏈均存在一個恒定區與可變區，輕重鏈之間存在二硫鍵鏈接。目前Fab抗體可以在實驗室中制備出來。

技術簡介：

單鏈抗體的制備：

scFv可在多個表達系統中進行表達，目前比較常用的，是大腸桿菌表達系統和哺乳動物表達系統。

另外可以使用噬菌體展示技術生產得到scFv片段，通過免疫動物得到雜交瘤細胞，從中提取cDNA，利用逆轉錄PCR得到全套抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，利用重疊PCR將VH和VL片段擴增得到可變區基因片段，然后將基因克隆到噬菌體載體中了，電轉感受態大腸桿菌，輔助噬菌體超染，得到的上清液即為單鏈抗體庫，以抗原為固相，經過3-5輪吸附-洗脫-擴增篩選，即可得到單鏈抗體。

Fab片段的制備：

目前有酶解法、利用表達系統制備以及利用噬菌體展示技術進行抗體庫篩選等方法進行Fab片段的制備。

酶解法：通常用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等對免疫球蛋白G進行降解，得到Fab，Fc片段等產物；

利用表達系統生產Fab片段：通常利用大腸桿菌表達系統與哺乳動物動物表達系統；大腸桿菌表達系統具有生產成本低，生產速度快等優點，但是容易形成包涵體，復性后活性難以保證活性；用哺乳動物表達，可以順利形成二硫鍵；更接近天然Fab結構，活性也更好；

噬菌體展示技術：制備Fab片段抗體庫，可經過熟輪的篩選富集，即可得到高親和性的抗體。

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