DNA/基因合成與純化

現如今固相亞磷酰胺三酯法是普遍采用的DNA合成方法，具有高效，快速偶聯的優點。其基本原理是：將核苷酸單體按照3′→5′磷酸二酯鍵鏈接，使其具有天然DNA分子的全部生物學活性和排列順序。同時，合成過程中將暫時不需要的基團保護起來以防止活躍基團發生連接反應生成副產物，且在下一輪縮合反應之前去除保護基以保證不斷形成專一的3′→5′核苷酸排列。

首先將欲合成的寡核苷酸鏈3′末端核苷(N1)以其3′OH通過1個長的烷基臂與固相載體保護。然后從N1開始逐步地接長寡核苷酸酸鏈：

1.        去保護：以苯磺酸(或三氯醋酸)處理帶有保護基的核苷，去除5′末端的DMTr，暴露出5′OH，經洗滌后進行下步反應。

2.        耦聯反應：加入經四唑激活的核苷N2，使之與核苷N1上的5′OH起耦聯反應，乙腈洗滌。

3.        加帽反應：加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未參加反應的寡核苷酸鏈(2%以下)乙酰化，乙酰化的鏈不參加下一步反應，如此有利于純化所需全長的DNA的片段。

4.        氧化反應：加入碘，使三價的亞磷酸轉變為更穩定的五價磷酸。

上述循環完成之后進行第二個合成循環。每經歷一輪循環，接長1個核苷酸。接長的鏈始終被固定在不溶的固相載體上，過量的未反應物或分解物則通過過濾或洗滌除去。當整個鏈達到預定的長度后，從固相載體上切下，氨解法脫去保護基，并經過分離純化得到所需要析后產物。 

DNA的純化常采用丙烯酰胺凝膠電泳純法，具體操作如下：

1.        從合成柱上洗脫的寡核苷酸片段，冰凍、干燥、去氨水，溶于適量水中后，占樣于15～20%丙烯酰胺凝膠制備膠上，按10V/cm條件電泳，過夜。

2.        電泳完畢后，取下凝膠于EB染色后觀察，或直接將含寡核苷酸片段的凝膠置于硅膠熒光板上(CMC板)紫外線燈下，根據分子量的標準切下所需的區段(呈黑色)，將膠塊置少量緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/L NaCl)，搗碎膠塊，25～42℃浸泡過夜(4～24小時)，或將膠塊置于有少量緩沖液的透析袋中，通電下，寡核苷酸片段即進入透折袋中。

3.        洗脫的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗滌，真空抽干后即可應用。

服務流程如下

1.        序列評定

2.        片段拼接

3.        克隆

4.        篩選

5.        核對測序結果

6.        凍干粉質粒